肝纤维化是一种慢性进行性疾病，其特征是细胞外基质（ECM）和胶原蛋白的过度沉积。活化的肝星状细胞（aHSCs）分泌胶原蛋白及纤连蛋白等多种细胞外基质，是肝纤维化的关键驱动者。外泌体（Exos）因其良好的生物相容性和较低的免疫原性，被认为是理想的药物载体，不过其存在产量低、载药能力有限、递送效率不足等问题。

在此背景下，吉林大学生命科学学院滕乐生教授和杨照罡教授团队于2025年6月在Biomaterials (IF=12.9)上发表了题为“Engineered exosomes for targeted microRNA delivery to reverse liver fibrosis”的文章，该团队开发了一种纳秒脉冲微流控系统（T-nsPMs），可以大量制备表面过表达CD47蛋白的外泌体，并在其表面修饰5HT1D抗体，这些修饰5HT1D抗体的外泌体（TCMExos）能靶向递送肝纤维化治疗小分子microRNA-29b（miR-29b）。TCMExos能有效穿透ECM、逃避巨噬细胞吞噬并靶向aHSCs，进而抑制TGF-β/SMAD 信号通路，显著减少ECM沉积，展现出优异的抗肝纤维化效果，为肝纤维化治疗提供了新策略。

定量蛋白质组学通过系统性分析蛋白质表达差异，为解析疾病机制、发现治疗靶点提供了强大工具。在本研究中，它成为破解肝纤维化靶向治疗难题的关键技术。文章中所用的定量蛋白质组学服务由诺禾致源提供。

研究思路

研究结果

1.T-nsPMs高通量制备外泌体

为促进外泌体的大规模制备并提高细胞转染效率，研究人员开发了纳秒脉冲微流控系统（T-nsPMs），该装置可显著提高外泌体的释放效率和细胞转染效率，且通过优化制备参数发现，电压为160 V时，细胞的转染效率以及活率达到最优。

图1 T-nsPMs装置可促进外泌体的高通量制备

2.5HT1D可作为肝纤维化的潜在治疗靶点

为了确定肝纤维化的潜在治疗靶点，研究人员对基因表达综合数据库（GEO）中HSCs和aHSCs的蛋白质组数据集（GSE119606和GSE228086）进行了分析。结果发现，与aHSCs相比，aHSCs中共有325种差异表达蛋白在两个数据集中均呈表达上调的趋势，随后对上调蛋白进行GO富集分析，发现这些蛋白多与ECM的形成相关；之后重点研究上调的膜蛋白，发现5HT1D（HTR1D）在aHSCs表面高表达，为了进一步探究5HT1D在体外和体内aHSCs中的表达，研究人员又进行了Western Blot和免疫组化实验。结果表明，在激活的HSC-T6细胞（aHSCs-T6）和肝纤维化大鼠模型的肝组织中，5HT1D均显著过表达。基于这些发现，选择5HT1D作为肝纤维化的潜在治疗靶点。

图2 肝纤维化治疗靶点的发现

3.TCMExos的制备和功能表征

为搭建用于治疗肝纤维化的体系，研究人员通过细胞转染等技术制备出可靶向aHSCs的药物载体TCMExos。之后为表征TCMExos的功能，研究人员分别进行体外和体内实验。体外实验：通过MTT测定，发现TCMExos对aHSCs-T6细胞有显著的抑制作用，通过免疫荧光染色和Western Blot实验发现，TCMExos可抑制aHSC-T6细胞中与纤维化相关的蛋白表达。通过transwell实验评估，证实了TCMExos可逃避kupffer细胞的吞噬作用。体内实验：为评估TCMExos在体内治疗肝纤维化的潜力，研究人员首先构建了肝纤维化大鼠模型，之后向肝纤维化大鼠静脉注射TCMExos。与对照组相比，TCMExos处理组中疾病大鼠的体重有所提升，肝细胞排列整齐，大小均匀，小叶结构清晰，这些结果都表明TCMExos可有效缓解大鼠的肝纤维化症状。Masson染色（胶原纤维减少）、Western Blot（胶原蛋白、纤连蛋白表达下调）、血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的浓度检测（ALT、AST表达下调）等实验也证实了TCMExos的处理可有效缓解大鼠肝纤维化症状。

图3 TCMExos的制备及表征

4.TCMExos治疗肝纤维化的作用机制

为阐明TCMExos在体内抗纤维化的治疗机制，研究人员通过蛋白质组学分析鉴定参与该过程的蛋白质。对疾病大鼠及经TCMExos处理的疾病大鼠肝组织进行定量蛋白质组学检测，结果共鉴定出4694种差异蛋白，其中810种蛋白质显著上调，3884种蛋白质显著下调。对这些差异蛋白进行GO功能注释、KEGG富集分析、亚细胞定位分析，结果发现TCMExos治疗肝纤维化的过程涉及多种生物学过程和分子功能，包括蛋白质磷酸化和肌动蛋白细胞骨架调控。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析显示，所有被调控的蛋白质均与抑制TGF-β信号通路或调控ECM有关。此外TCMExos处理可下调胶原蛋白的表达，表明其在ECM降解中发挥重要作用，而ECM降解是逆转肝纤维化的关键过程。综上所述，TCMExos可抑制TGF-β/SMAD信号通路发挥抗纤维化作用。

图4 TCMExos治疗肝纤维化的作用机制

研究结论

本研究开发了一种纳秒脉冲微流控系统（T-nsPM），可大量制备表面过表达CD47蛋白的外泌体，并在其表面修饰5HT1D抗体，构建纳米药物递送体系，能靶向aHSCs递送miR-29b，实现治疗肝纤维化的作用。研究通过Astral DIA蛋白质组学技术，系统揭示了TCMExo通过抑制TGF-β/SMAD通路逆转肝纤维化的分子机制。这一成果表明，蛋白质组学在“发现靶点-验证疗效-解析机制”的完整研究链条中具有不可替代的作用。

图5 TCMExos的制备和作用机制示例图