黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花生长过程中最具毁灭性的病害之一，严重影响了棉花的产量和品质。探究棉花应答黄萎病菌的分子机制，发掘抗病基因并将其用于育种，是提高棉花黄萎病抗性最直接和有效的策略。

在植物的免疫反应中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径“MAPKKK-MAPKK-MAPK”已经被证明在响应病原物入侵过程中发挥了重要作用。MAPKKK类激酶主要分为两类：MEKK-like和Raf-like。在该级联途径中，MEKK-like MAPKKKs的功能研究较为清楚，而Raf-like MAPKKKs的功能研究则知之甚少。此外，大多数MAPK相关研究集中在“MAPKKK-MAPKK-MAPK”级联途径的发掘，而对其下游底物及涉及的分子通路的研究还相对较少。目前对于MAPK下游调控网络在棉花黄萎病应答中的分子机制仍不明确。

6月6日，南京农业大学棉花遗传与种质创新团队在《Advanced Science》(IF=14.3)上在线发表了题为“GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a Regulates the GhERF1b-and GhABF2-Mediated Pathways to Increase Cotton Disease Resistance”的最新研究成果^[1]。该研究揭示了棉花GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a磷酸化途径激活乙烯响应因子GhERF1b的转录并促进PR基因表达，同时抑制ABA响应基因GhABF2的表达调控气孔开放，进而促进棉花对黄萎病抗性的分子新机制。CQ9电子为该研究提供了磷酸化修饰蛋白质组检测服务。 

01研究思路

GhMPK9- GhRAF39_1- GhWRKY40a 模块用于提高棉花对大丽轮枝菌抗性的模型

02研究结果

研究人员先是通过农杆菌介导的遗传转化成功生成了GhMPK9过表达（OE）棉花品系。在五个OE品系中（OE1、OE2、OE5、OE7、OE10），GhMPK9的转录水平显著高于野生型（WT），且生育力、纤维质量和产量均无明显差异。接种V991后，与WT相比，GhMPK9过表达品系表现出较轻的病害症状，且菌丝积累和真菌恢复能力均明显降低。结果显示，GhMPK9表达水平与抗病性呈剂量相关关系。随后进一步选择OE2和OE10在正常和V991条件下进行转录组分析，发现OE2和OE10在两种条件下均显著上调大量抗病相关基因，如WRKYs、ERFs、NBS-LRRs、PRs、CRKs和P450s。总之，过表达GhMPK9可激活植物免疫反应并调节气孔运动，从而增强对大丽花病毒（V. dahliae）的抵抗力。

图1 GhMPK9基因的克隆与表达分析

研究人员之前在全基因组范围内鉴定了棉花MAPK家族成员，发现GhMPK9基因在棉花对黄萎病的响应中起重要作用。克隆分析显示GhMPK9与GhMPK13在系统发育上同源于AtMPK3，表达分析显示GhMPK9在根和茎中的表达高于GhMPK13。RT-qPCR结果表明，接种V. dahliae后，易感品种TM-1的MPK9表达显著高于抗病品种H7124，表明MPK9在不同棉花品种的免疫中起关键作用。亚细胞定位实验显示GhMPK9定位于细胞核和质膜。通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）分析，证实沉默GhMPK9增加棉花对V. dahliae的易感性，进一步验证了GhMPK9在棉花防御响应中的功能。为了研究GhMPK9的生物学功能，作者生成了GhMPK9 RNA干扰（RNAi）株系，发现这些株系未能产生棉铃和种子，且其雄蕊和雌蕊发育异常，表明GhMPK9在棉花生殖发育中同样发挥重要作用。

图2 GhMPK9、GhRAF39_1和GhWRKY40a之间的互作验证

为了探究GhMPK9的下游关键调控基因，作者在1458个过表达株系中上调的DEGs中进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），并引入了之前V991感染陆地棉的转录组数据。通过WGCNA，作者鉴定了六个共表达基因模块，其中GhMPK9和其他468个基因在MEblue模块中，于接种后12小时达表达峰值，这些基因显著富集于MAPK活性激活、细胞对胁迫的响应和芥子碱生物合成过程中。作者构建了GhMPK9的共表达网络，发现其中包含多个WRKY转录因子。比较不同RNA-seq样本中这些WRKYs的表达谱，确定GhWRKY40a与GhMPK9表达最为接近。选择GhWRKY40a作为关键候选基因，发现其与GhMPK9在组织表达模式上相似。酵母双杂交（Y2H）和α-半乳糖苷酶活性实验表明GhMPK9与GhWRKY40a互作。双分子荧光互补（BiFC）和GST pull-down实验进一步确认了这种互作。荧光素酶互补成像（LCI）实验也检测到了两者之间的互作信号。然而，GhMPK9未能直接磷酸化GhWRKY40a。

图3 GhMPK9、GhRAF39_1和GhWRKY40a在棉花抗病反应中的功能

由于GhWRKY40a并非GhMPK9的直接磷酸化底物，研究人员进行 OE10和WT进行了磷酸化蛋白组分析，以挖掘GhMPK9的下游底物。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，共鉴定了4955个磷酸化位点，包括3852个丝氨酸位点、989个苏氨酸位点和114个酪氨酸位点，并获得了2312个磷酸化蛋白的4092个磷酸肽。其中，1923个稳定磷酸化蛋白在OE10和WT中均被鉴定出来。差异磷酸化分析发现许多MAPK级联基因在磷酸化水平上存在显著差异，其中GhRAF39明显被激活。系统发育分析显示棉花基因组中有六个GhRAF39同源基因，具有高度保守的结构域，而GhRAF39_1在所有组织和器官中的表达水平最高。基序预测分析表明GhRAF39_1的潜在磷酸化位点可能是Ser27在烟草叶片表皮的亚细胞定位实验显示，GhRAF39_1在正常和接种V991条件下均定位于细胞核和质膜。为了进一步明确激酶-底物关系，作者将His和MBP标签加到GhMPK9上，将GST标签加到GhRAF39_1上。在GST pull-down实验中，His-GhMPK9蛋白被GST-GhRAF39_1蛋白拉下。在磷酸化实验中，仅在GST-GhRAF39_1与MBP-GhMPK9共孵育时，通过自显影显示出清晰的磷酸化带，表明GhMPK9具有激酶活性，并在体外通过磷酸化激活了GhRAF39_1 ，这些结果为理解棉花抗病机制中GhMPK9的作用及其下游调控网络提供了重要线索。

图4 GhMPK9 与 GhRAF39_1 物理相互作用，并使 GhRAF39_1 磷酸化

在探索棉花细胞内信号传导机制时，研究人员通过酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光互补（LCI）实验验证了GhRAF39_1能够与GhWRKY40a相互作用。GST pull-down实验也显示了GhRAF39_1能有效拉下GhWRKY40a蛋白。另外，GhWRKY40a、GhMPK9和GhRAF39_1都定位于细胞核中，暗示它们可能作为一个复合体共同作用。GST pull-down实验显示，GhWRKY40a和GhMPK9都能被GhRAF39_1拉下，证实了它们在细胞核中形成了一个三元复合物。通过Western blot分析，当GhMPK9和GhRAF39_1共同存在时，GhWRKY40a显著磷酸化，说明GhMPK9-GhRAF39_1模块激活了GhWRKY40a的磷酸化。进一步的磷酸化位点分析显示，GhRAF39_1的丝氨酸和苏氨酸位点对GhWRKY40a的磷酸化至关重要。研究人员揭示了GhRAF39_1在GhMPK9介导的GhWRKY40a磷酸化过程中的发挥关键的辅助作用。

图5 GhWRKY40a 被 GhMPK9- GhRAF39_1 模块磷酸化

为了探究GhMPK9、GhRAF39_1和GhWRKY40a在棉花抗病反应中的潜在功能，研究人员通过VIGS策略分别沉默了抗病棉花品种Hai7124中的GhMPK9、GhRAF39_1和GhWRKY40a同源基因。研究表明，棉花品种G. hirsutum对黄萎病易感，而G. barbadense则具有更强的抗病性。作者对比了两个品种的GhMPK9、GhRAF39_1和GhWRKY40a同源基因序列，发现它们之间没有差异。在实验中，沉默GhMPK9、GhRAF39_1和GhWRKY40a的棉花幼苗对黄萎病的抗性显著降低。与对照组相比，这些基因沉默的幼苗在接种黄萎病菌V991后表现出更高的易感性，病情指数显著增加，茎部真菌积累也明显增多。这些结果表明，GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a模块在调节棉花对黄萎病的响应中起着关键作用。

图6 GhMPK9、GhRAF39_1 和 GhWRKY40a 在棉花抗轮纹病中的作用

研究人员为了一步揭示GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a模块在棉花抗黄萎病中的作用机制，对基因沉默处理后的棉花幼苗进行了转录组测序。结果显示，沉默GhMPK9和GhWRKY40a后，许多与乙烯信号转导相关的基因表达显著下调，表明该模块通过调控乙烯信号途径增强棉花的抗病性。研究发现，GhERF1b是该模块的关键下游转录因子。GhWRKY40a可以结合GhERF1b的启动子，并通过GhMPK9-GhRAF39_1模块介导的磷酸化显著提高其活性。VIGS分析证实，沉默GhERF1b后，棉花对黄萎病的抵抗力显著下降，真菌积累增加，多个抗病基因的表达下调，从而增强了棉花对黄萎病的抗性。

图7 GhMPK9-GhRAF39_1介导的GHWRKY40磷酸化提高棉花对黄萎病的抗性

在分析GhMPK9过表达转基因棉花的转录组数据时，发现GhMPK9过表达可调控气孔发育和分布。气孔通过介导气体交换和水汽调节植物的内部温度和湿度，这直接影响黄萎病菌的感染程度。研究显示，GhMPK9、GhRAF39_1和GhWRKY40a都参与了棉花气孔的开闭调节。分析发现，GhMPK9过表达棉花中GhABF2蛋白显著减少，而GhWRKY40a可以直接结合GhABF2的启动子区，从而抑制其转录活性。GhABF2作为负调控因子，其沉默后，棉花的病叶率降低，失水率增加，茎部真菌积累减少。这表明GhMPK9-GhRAF39_1介导的GhWRKY40a磷酸化抑制了GhABF2的表达，从而诱导气孔打开，降低植物内部湿度，增强棉花的抗黄萎病能力。

图8 GhMPK9-GhRAF39_1介导的GhWRKY40a磷酸化降低了其结合GhABF2启动子的能力，而提高了棉花对黄萎病的抵抗力

03研究结论

本研究通过磷酸化蛋白质组学揭示了棉花应答黄萎病菌的分子机制：GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a磷酸化途径激活乙烯响应因子GhERF1b的转录并促进PR基因表达，同时抑制ABA响应基因GhABF2的表达调控气孔开放，促进棉花对黄萎病抗性。这一发现为棉花抗黄萎病机制研究、基因筛选和育种改良以及生物控制策略的制定提供了重要的线索和依据。这些发现有助于深入了解棉花的抗病机制，并为解决黄萎病问题提供了新的思路和方法。

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参考文献：Mi X, Li W, Chen C, Xu H, Wang G, Jin X, Zhang D, Guo W. GhMPK9-GhRAF39_1-GhWRKY40a Regulates the GhERF1b- and GhABF2-Mediated Pathways to Increase Cotton Disease Resistance. Adv Sci (Weinh). 2024 Jun 6:e2404400.