控制肉鸡腹部脂肪过度沉积一直是家禽育种领域关注的核心问题。研究表明肉仔鸡体内过量的脂肪积累会降低饲料转化效率，减少瘦肉率，肉种鸡过肥会严重影响产蛋率、受精率和孵化率，并且会诱导脂肪肝综合症的发生，从而加大了产蛋期的死淘率。由此看来，肉鸡体内沉积过多的脂肪将会给生产者、加工者和消费者造成显而易见的经济损失。然而，肉鸡腹脂性状是典型的数量性状，受微效多基因调控，其调控机制非常复杂。目前，国内外学者基于SNP芯片和二代测序等高通量基因分型技术，通过全基因组关联研究（GWAS）等方法已经获得了一批与肉鸡体脂性状表型变异具有统计学关联的基因组变异，但这些变异的确切作用和机制仍然不清楚。

2024年10月28日，东北农业大学动物科学技术学院农业农村部鸡遗传育种重点实验室在国际SCI期刊Nature Communications（IF：14.7）上发表题为“Integrative 3D genomics with multi-omics analysis and functional validation of genetic regulatory mechanisms of abdominal fat deposition in chickens”的研究文章。该工作全面解析了肉鸡腹部脂肪沉积的调控机制，为后续液相芯片的开发、全基因组选择育种以及基因编辑育种提供了理论依据。CQ9电子为本研究提供了全基因组重测序和转录组测序服务，原始数据由研究团队自行分析。

研究材料

330只东北农业大学高、低腹脂双向选择品系第19世代7周龄公鸡，包括160只高脂系公鸡和170只低脂系公鸡。这些鸡在相同的环境条件中按照常规商品肉鸡饲养程序统一进行饲养管理。在7周龄（出栏日龄）时测量鸡的体重（BW7），随后翅静脉采血，EDTA-Na2抗凝，酚-氯仿抽提DNA后，TE溶解-20 ℃保存，用于后续测序。7周龄屠宰后测定其腹脂重（AFW）和腹脂率（AFP = AFW/BW7）。

研究结果

1.与脂肪沉积相关的候选变异

研究发现，虽然330只肉鸡在7周龄时体重相似，但高脂系（FL）和低脂系（LL）的鸡在腹脂重和腹脂率上有显著差异。通过对这两个品系的330个肉鸡进行全基因组重测序（WGS）和基因型分型分析，共鉴定了4,677,252个高质量的INDEL和SNP，通过计算全基因组的固定指数（Fst）和θπ比率，鉴定出2301个与腹脂沉积（AFD）性状相关的选择区域，其中72.23%与已知的QTLs重叠。进一步，在这2301个选择区域中共识别出311,947个与AFD性状相关的候选变异，主要位于非编码的基因间/内含子区域。这些变异的鉴定为研究AFD性状的遗传基础提供了重要线索。

图1 通过基因组分析鉴定肉鸡品系中与脂肪沉积的候选变异

2.利用表观基因组技术鉴定潜在的调控脂肪沉积的功能变异

该研究分别从高、低脂系肉鸡群体中选取3个样本进行了ATAC-seq，共鉴定了FL和LL之间4028个DOCRs，这些DOCRs主要富集于转录起始位点（TSS）附近。然后，利用ChIP-seq数据将这些DOCRs注释为不同的顺式调控元件（REs），包括启动子、增强子、沉默子、CTCF富集区域和低信号区域。通过综合分析ATAC-seq和ChIP-seq数据，在注释的REs中识别出2162个潜在的功能性变异。其中，约一半变异显著富集于三维基因组高阶结构相关的CTCF结合位点附近，而其余变异位于远端REs如增强子、超级增强子、沉默子和超级沉默子中。

图2 肉鸡品系中与脂肪沉积相关的功能性变异

3.通过三维基因组鉴定变异-基因互作网络

为了研究2162个潜在功能变异如何影响基因调控机制，利用Hi-C技术对FL和LL的腹脂组织进行了高分辨率全基因组染色质互作图谱绘制，并揭示了FL和LL基因组中复杂的染色质结构。此外，通过构建FL和LL的个性化三维（3D）染色质模型，揭示了高、低脂系之间显著的结构差异。本研究在不同分辨率下对高、低脂系的A/B compartment、TADs和loops进行了表分析，发现两者的compartment高度保守，而TADs和loops有显著差异。此外，鉴定出1169个通过影响染色质结构（如近端和远端调控元件、TADs和环结构）调控500个靶基因表达的功能性变异，形成了一个复杂的2559个变异–基因互作网络。

图3 FL和LL亚群的染色质结构差异以及功能性变异的目标基因

4.WGCNA揭示了与脂肪沉积相关的基因组变异-基因互作网络

确定了潜在功能性变异的靶基因后，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）来分析了靶基因表达与脂肪性状之间的关联，从而建立与AFD性状相关的综合变异-基因网络。通过分析，共鉴定了439个受1134个功能性变异调控的与AFD显著相关的靶基因，涉及2255个变异-基因互作网络。GO和KEGG富集分析进一步确认，这些基因与脂质代谢相关的通路高度相关，主要涉及信号转导、代谢过程和细胞生长与死亡等通路。

图4 WGCNA和功能富集分析

在此基础上，本研究结合基因组学、表观基因组学、3D基因组学和转录组学数据构建了创新的IMVGI（Integrative Multiomics for Variant–Gene Interactions）方法，用于构建肉鸡AFD性状的变异-靶基因互作网络。通过IMVGI，共识别了1134个功能性变异和439个靶基因，这些功能变异主要分布在增强子相关区域和与三维基因组高阶结构相关的CTCF结合位点区域。同时，与对照组Non-IMVGI变异相比，IMVGI变异在表观基因组特征、转录因子结合和QTL区域显著富集。并且，与其他方法相比，IMVGI模型能够预测更多的远端目标基因，且这些目标基因在高、低脂系材料中的表达差异更大。

图5 与AFD性状相关的变异-基因相互作用的功能分析

5.IMVGI变异rs734209466作为等位基因特异性增强子，促进IGFBP2和IGFBP5的转录。

在IMVGI模型识别的2255个变异-基因互作中，选择了SNP rs16596562 (G > A) 和InDel rs734209466（一个13个碱基对的InDel）两个位点进行试验验证，通过sanger测序和关联分析证实了rs16596562-A和rs734209466-In是影响AFD性状的潜在功能等位基因。随后，通过荧光素酶报告基因实验验证了rs16596562-A和rs734209466-In等位基因显著增加了增强子活性。IMVGI模型预测rs16596562和rs734209466可能通过染色质loop直接与远端靶基因IGFBP2和IGFBP5的启动子区域互作。通过荧光素酶报告基因实验进一步证明了rs734209466通过染色质loop直接与远端靶基因IGFBP2和IGFBP5的启动子区域互作，而不是rs16596562。

图6 rs734209466提高 IGFBP2和IGFBP5启动子的转录活性

6.转录因子IRF4介导rs734209466处差异等位基因增强子活性

鉴于rs734209466-In等位基因与IGFBP2和IGFBP5表达增加相关，假设rs734209466-In比rs734209466-Del更容易与增强子相关的转录因子结合。基于Homer和Animal TFDB分析转录因子结合位点，发现rs734209466-In上存在一个特定的IRF4结合位点。通过EMSA和Super-EMSA实验，验证了IRF4可以直接与rs734209466-In结合进而调控增强字活性。同时，RT-qPCR结果显示，与对照组相比，IRF4过表达组的目标基因IGFBP2和IGFBP5的mRNA表达水平显著升高。

图7 转录因子IRF4介导rs734209466的不同等位基因活性

7.IGFBP2和IGFBP5通过促进前脂肪细胞的增殖和分化来影响脂肪沉积。

为了研究IGFBP2和IGFBP5表达水平的变化是否会影响与AFD性状相关的细胞表型，分别分析了干扰和过表达IGFBP2和IGFBP5对鸡前脂肪细胞增殖和分化的影响。CCK8、EdU染色、流式细胞技术结果表明IGFBP2和IGFBP5促进了鸡前脂肪细胞的增殖，红油O染色和RT-qPCR结果表明，IGFBP2和IGFBP5促进了鸡前脂肪细胞的分化。

图8 沉默和过表达IGFBP2和IGFBP5对脂肪沉积的影响

小结
本研究使用腹部脂肪含量不同的东北农业大学肉鸡高、低脂双向选择品系（NEAUHLF）作为实验群体从三维基因组角度鉴定影响肉鸡腹脂沉积的关键基因组变异，并解析具体调控机制。通过整合多组学数据构建了IMVGI，并利用IMVGI鉴定了1134个功能性变异和439个靶基因。通过多种分子生物学手段，验证了等位基因特异性增强子rs734209466通过与转录因子IRF4结合促进IGFBP2和IGFBP5的转录，且IGFBP2和IGFBP5通过促进前脂肪细胞的增殖和分化来影响脂肪沉积。此研究全面解析了肉鸡脂肪组织生长发育的机制，为肉鸡分子育种提供重要的理论依据。

关于CQ9电子基因选择育种业务

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参考文献

[1] Shen L, Bai X, Zhao L, et al. Integrative 3D genomics with multi-omics analysis and functional validation of genetic regulatory mechanisms of abdominal fat deposition in chickens[J]. Nature Communications, 2024, 15(1): 9274.